干细胞在异种动物体内的移植技术
| 来源：科技日报 |
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干细胞移植是一种对多种疾病有效的治疗方法，但是对于干细胞移植后在体内的生物学行为所知甚少，使其临床应用在目前仍受到相当的限制。宫内移植是近年来发展起来的一种干细胞移植技术，它将移植的时间推前到胎儿时期，由于胎儿早期的免疫系统尚未发育成熟，因此对移植的外源细胞产生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后进行免疫移植治疗。干细胞宫内移植作为一种新的产前治疗手段，对一些目前难以根治的先天性/遗传性疾病的治疗提供了一种新的手段。 干细胞移植是一种对多种疾病有效的治疗方法，但是对于干细胞移植后在体内的生物学行为所知甚少，特别是由于难以寻找到合适配型的供者、移植后常出现的宿主抗移植物反应和需长期进行免疫抑制治疗等问题，使其临床应用在目前仍受到相当的限制。宫内移植是近年来发展起来的一种干细胞移植技术，它将移植的时间推前到胎儿时期，由于胎儿早期的免疫系统尚未发育成熟，因此对移植的外源细胞产生免疫耐受性而不予以排斥，也不需要移植后进行免疫移植治疗。干细胞宫内移植作为一种新的产前治疗手段，对一些目前难以根治的先天性/遗传性疾病的治疗提供了一种新的手段，此外，通过干细胞宫内移植技术构建人/动物嵌合体对深入研究人干细胞在体内的归巢、分化、基因表达特征、可塑性和组织损伤的修复等提供了新的思路和良好的模型。本成果开展了以下几个方面的工作： 简要技术 1.在B－超监视下，通过人源干细胞宫内移植途径进行了大规模的人/山羊异种移植嵌合体的研制，首次建立了人/山羊嵌合体动物模型，在B超监视和引导下，将来源于人脐带血CD34＋Lin－细胞注射到孕期为45—65天的胎山羊腹中，定期用B超观察胎羊的生长发育情况，并观察母羊的生理反应和免疫耐受情况。胎羊出生后，综合应用分子生物学、分子细胞遗传学、细胞生物学、免疫组织化学等技术证明人源干细胞可在山羊体内长期存活，目前已获得32头嵌合体山羊，人源细胞在山羊体内存活的最长时间已达2年以上。 2.开展了嵌合体山羊体内人源细胞多器官移植存活、分化和基因表达特征的研究。为探讨宫内移植的人源干细胞在山羊体内的分布和分化情况，构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因反转录病毒载体并将其转导到人造血干细胞中（GFP+细胞），进行山羊宫内移植获得人/山羊嵌合体，然后综合应用FACS、PCR、实时定量PCR、RT－PCR、FISH和免疫组化等方法在人/山羊嵌合体活体水平追踪和观察人源细胞的体内行为特征。结果显示，人源干细胞在山羊的血液、肝、肾、肌肉、肺等器官高比例的归巢并分化成相应的人的组织细胞（如人肝样细胞，表达人血清白蛋白、人肝细胞特异抗原和人肝核因子等），显示了广泛的可塑性。 3.开展了干细胞可塑性机制的研究。应用流式细胞仪分选经灌流的嵌合体山羊肝脏中的人源细胞(GFP+细胞)，经过分子生物学技术鉴定，证明存在于山羊体内的GFP+细胞确实是人细胞；表明移植于山羊体内的人源干细胞的可塑性并非由细胞融合机制所致。 4.应用基因芯片分析了人/山羊嵌合体中人源基因的表达谱。应用AffymetrixU 5.构建了更昔洛韦（GCV）可诱导的转HSV－tk基因小鼠肝损伤动物模型和异体或异种移植嵌合体小鼠模型，活体水平证明造血干细胞宫内移植可有效的修复肝损伤，构建了转HSV－tk基因小鼠肝损伤物动模型，然后在胎鼠妊娠12天时通过宫内移植干细胞的技术获得具有异体或异种（人）细胞的嵌合体小鼠模型，小鼠出生后利用GCV诱导特异肝损伤，并通过血液生化，肝脏免疫组织化学，分子检测等分析外源干细胞在受体肝脏的增殖与对肝损伤修复情况，结果显示，大部分宫内移植阳性鼠在GCV处理后，血清生化学指标，如AST，ALT和ALP等没有明显改变，损伤28天后通过肝脏病理学分析也证实移植鼠肝结构基本正常，未见灶性坏死，炎性细胞浸润增生等肝脏损伤组织病理形态学变化，PCR结果表明肝脏存在供体细胞。异种异体嵌合模型的RT－PCR和免疫组织化学结果也显示有相应人源肝脏特异基因的mRNA表达和肝特异蛋白的存在，提示宫内注射的供体细胞在损伤条件下可能归巢到肝脏并在肝脏增殖，参与损伤肝的修复和再生，从而对肝损伤有保护效果。 技术创新 1.首次获得了人/山羊异种移植嵌合体，建立的B超监视下于山羊孕早期（45—65天）进行人成体干细胞宫内移植，具有创伤低、排异率低、成功率高等优点； 2.首次应用山羊作为大动物进行人成体干细胞异种移植的模型来生产和贮存人源性造血细胞和肝脏细胞； 3.首次应用GFP标记来分析人体干细胞在山羊活体内的生物学行为特征； 4.综合应用分子生物学、细胞生物学、免疫学、遗传学、组织学等多学科技术，系统地研究嵌合体山羊体内人源细胞的分化和表达特征； 5.首次应用基因芯片分析人/山羊嵌合体的人源基因的表达谱； 6.首次将肝脏损伤与干细胞宫内移植结合起来进行肝损伤治疗的研究，为肝脏疾病的治疗提供了新的思路和技术途径。 应用前景 含有高比例人源细胞的人/动物嵌合体具有以下理论和实际意义： 1.为研究干细胞在活体内的生物学行为提供新的思路和材料来源； 2.为实现异种器官移植和细胞治疗提供丰富的物质基础和材料来源； 3.为通过干细胞宫内移植进行疾病的产前治疗提供理论和技术手段； 4.以人/动物嵌合体的器官（如肝脏）作为生物反应器，为人源蛋白的生产开辟了新的途径。 |
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